聚乙二醇（PEG-8000）沉淀法常压浓缩慢病毒与逆转录病毒

背景与痛点

在构建稳转株、进行 CRISPR 全基因组筛选文库递送或感染原代免疫细胞（如 T 细胞、巨噬细胞）时，高滴度（$\ge 10^8\ \text{TU/mL}$）的慢病毒是决定实验成败的生命线。然而，293T 细胞三质粒或四质粒共转染包装后收集的未经浓缩上清，初始滴度通常仅有 $10^5\sim 10^6\ \text{TU/mL}$。传统浓缩方案必须依赖超速离心机在 $50,000\times g \sim 100,000\times g$ 下超离 2 小时，多数中小型实验室根本没有昂贵的高端超离设备和专用水桶转子；而市售浓缩柱（Amicon 滤膜管）极易发生严重堵孔和膜不可逆吸附蛋白损失。

巧思与生物高分子排阻机制

2009 年 Kutner 等人在 Nature Protocols 系统确立的 PEG 沉淀浓缩法，基于经典高分子物理化学中的热力学体积排阻效应（Volume Exclusion Effect）：

1. 大分子链夺取溶剂自由水：聚乙二醇 8000（PEG-8000）是无毒的长链非离子型亲水聚合物。溶解在溶液中时，PEG 的大量螺旋链束占据了绝大部分溶液自由水体积，并将周围自由水分子紧密水合。
2. 表面电荷屏蔽促聚集：病毒颗粒（外包被囊膜直径约 $80\sim 120\ \text{nm}$）在水溶液中本靠负电荷相互排斥稳定悬浮。在 $0.3\sim 0.4\ \text{M}\ \text{NaCl}$ 高离子强度下，电荷双电层被屏蔽；由于周围没有足够自由水接纳外包被囊膜，大量病毒颗粒在熵驱动下发生疏水自组装相分离，形成肉眼可见的微小聚集体。这种大聚集体只需在普通台式离心机（$1,600\times g \sim 3,000\times g$）即可彻底沉淀到底部。

5× PEG 沉淀母液配方与实操规程

5× PEG-IT 沉淀浓缩液配制（100 mL）

• PEG-8000 粉末：$40\ \text{g}$（终质量浓度 $40\%\ \text{w/v}$）
• 氯化钠（NaCl）：$7.0\ \text{g}$（终浓度约 $1.2\ \text{M}$）
• 加入超纯水加热促溶至 $100\ \text{mL}$，微波低火或 $60^\circ\text{C}$ 水浴温育搅拌至澄清透明。
• 高压蒸汽灭菌（$121^\circ\text{C}$，20 分钟），灭菌后可 $4^\circ\text{C}$ 长期存放数年。

简易浓缩标准化流程

1. 上清收获与粗滤：在转染 48 小时与 72 小时分别收集 293T 细胞的慢病毒上清，以 $500\times g$ 离心 5 分钟 沉淀漂浮的细胞碎屑；上清经 $0.45\ \mu\text{m}$ 针头滤器过滤（严禁用 $0.22\ \mu\text{m}$ 滤膜，因囊膜糖蛋白过大易被截留）。
2. 加液混匀与 4 ℃ 孵育：
   • 按 4 份病毒上清 : 1 份 5× PEG 母液 的体积比例混合（例如 20 mL 上清加入 5 mL PEG 浓缩液）。
   • 上下颠倒轻柔混匀 10 次，置于 $4^\circ\text{C}$ 冰箱避光静置孵育过夜（或至少 8~12 小时）。
3. 低速离心沉淀：
   • 第二天将离心管置于常规冷冻离心机中，以 $1,600\times g \sim 3,000\times g$（$4^\circ\text{C}$）离心 30 分钟。
   • 离心结束后，可在管底和管壁侧面清晰观察到米白色到米黄色的细小沉淀物。
4. 重悬与分装保存：
   • 极其缓慢地倾倒或用移液枪吸尽上清，倒立在吸水纸上沥干 1 分钟。
   • 向沉淀中加入初始体积的 $1/50\sim 1/100$ 的无菌冷 $1\times\text{PBS}$ 或 Opti-MEM 培养基（例如 20 mL 初始上清加入 $200\sim 400\ \mu\text{L}$ PBS）。
   • 冰上轻柔吹打数次使其完全溶解，小体积（$20\sim 50\ \mu\text{L}$/管）分装，立即放入 $-80^\circ\text{C}$ 冻存，避免反复冻融。